研究内容

0. 研究の概要

生命は生体内における物質の質的な変化、量的な流れの微妙な調節によって保たれている。薬物の作用もまた生体内の薬の動きによって大きく影響を受ける。試験管の中では薬理作用を持つ化合物も、生体内に投与した場合には必ずしも期待される効果が得られない事があるのは周知の事実である。これは投与された化合物の濃度や暴露時間を十分確保できないためである。従って、生体内での薬の動きを予測し、薬効が期待できるのかどうか早い段階で評価する方法論の開発は医薬品開発のリスクを大きく軽減することができる。また、薬の排泄経路についても、単一の消失経路では薬物間相互作用や遺伝子多型など個人差の影響を受けやすいため複数の排泄経路を持つ医薬品を開発することがより安全な医薬品による疾病治療のためには必要である。その上で、標的臓器に選択的に薬を分布させるようなドラッグデリバリーシステム(DDS)を開発し、薬の体内動態を制御することで、医薬品による疾病治療の効率が飛躍的に上昇することが期待される。当研究室では、これを最終目標におき、薬の体内動態における支配要因の解析、特に生体膜透過機構の解明を行っている。

これまで、医学、薬学の分野では、個体レベルでの現象の本質(機構)を理解するために、臓器、細胞、蛋白、遺伝子レベルへと遡る解析的な研究が推進され、大いなる成果をあげてきた。しかしながら、こうして解明された分子レベルでの機構をもとに、個体レベルでの現象を定量的に再構築する事を可能にするような方法論が開発されない限り、“効果と安全性の予測と制御”という上記の目的を果たすことはできない。医薬品が最終的に薬効を発揮するためには、(1)投与部位から循環血中への吸収過程、(2)代謝、排泄などの解毒過程、(3)薬効、副作用に関わる組織への移行過程、(4)薬効に関わる受容体への結合、それに続く薬効発現などの諸過程を経なければならない。これらの諸過程は、臓器血流、細胞内外のpH差、電位差などの生理解剖学的パラメーターと、血中、組織中の蛋白への結合性、生体膜透過性、輸送担体(トランスポーター)および代謝酵素と薬物の相互作用、薬効および副作用に関わる受容体への結合、情報伝達過程などを表す生化学的パラメーターにより表現することが可能である。従って、これらパラメーターを適切な数学モデルに組み込むことにより、“薬の投与量、投与経路”、“投与される患者の病態”という入力情報から、“薬効および副作用の発現”という出力を予測する事を試みており、既にいくつかの成功例を得ている。実際に動いている実験手法は、細胞生物学、分子生物学の研究室と同様のものが多いが、その背景となっている”生体内でのダイナミックな薬物分子、蛋白分子の動きを定量的に解析をする”という基本理念において、他の研究室との違いがあると考えている。現在、具体的に進行している研究テーマは下記の5つに分けることができる。

1. 生理学的薬物速度論モデルによる薬物体内動態予測法の確立

薬物による効果、副作用を予測するためには、薬物血中濃度推移の予測が必須である。血中濃度推移は、1)肝での代謝、排泄クリアランスおよび腎での排泄クリアランス、2)種々の組織への分布の程度(分布容積)により記述することができる。ヒトにおけるこれらパラメーターを、種々のin vitro実験系(単離細胞膜、遊離細胞、灌流臓器)で得た測定値(代謝、輸送、結合)をもとに、生理解剖学的パラメーターと結合し、適切な数学モデルを用いて予測する方法論を開発している(図1)。腎クリアランスについては、実験動物での情報をもとにアニマルスケールアップの手法を適用することにより、ヒトでの値を予測することに多くの例で成功している。しかし、肝代謝クリアランスや肝取り込み、胆汁中排泄クリアランス、消化管吸収クリアランスなどについては動物種差が大きいため、ヒトの組織やミクロソーム、P450発現系などを用いたin vitro代謝実験、輸送実験で得られたデータをもとに、in vivoでの代謝、輸送クリアランスを予測することを試みている。また、近年、種々の薬物間相互作用に基づく副作用の発現が問題となっており、社会問題ともなっている。薬物間相互作用により変動し得る体内動態の要因としては、薬物の吸収、血漿蛋白結合、トランスポーターによる生体膜透過、および代謝が挙げられる。現在、主に代謝、排泄における薬物間相互作用を、in vitro実験によりできるだけ精度よく予測するための方法論について検討している。更にデータマイニングの手法を取り入れ、文献データに現在の分子論的理解を加えることで、体内動態の個人差の予測、薬物間相互作用の予測を行っている。こうした研究は、最終的には副作用の少ない医薬品の開発、使用法の確立につながるものであり、“薬学研究”に関わる者としての使命を感じながら研究を進めている。


図1 生理学的薬物速度論に基づいた薬物体内動態の予測

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2. 薬物の血液脳関門および血液脳脊髄液関門透過機構の解明、および脳内動態予測法の確立

In vivo系での中枢における薬物動態を予測するためには、血液と中枢とのインタフェースとなっている血液脳関門・血液脳脊髄液関門を介した薬物輸送能力を知ることが必要である。In vitroならびにin vivoでの解析を通じて、多くの興味ある事実が見出された。血液脳関門・血液脳脊髄液関門の関門機構はこれまで内皮細胞間あるいは上皮細胞間の密着結合などに由来するものと解釈されてきたが、最近の速度論的、分子生物学的研究により、”いったん脳内皮細胞に取り込まれた異物が、P-glycoproteinなどのトランスポーターの働きにより能動的に血液中に汲み出されているために正味の脳移行が制限されている”ことが明らかにされている。加えて関門では抱合酵素なども発現しており、血液脳関門・血液脳脊髄液関門は、これまで考えられていたような静的な壁ではなく、トランスポーターや代謝酵素など異物解毒機構により構成されるよりダイナミックな障壁であることが認識され始めている。

中枢から血液中へのくみ出し過程には、脳実質内・脊髄液内から内皮・上皮細胞内への取り込みと細胞内から血液中へのくみ出しの2つの過程から成り立っている。当研究室で最近開発された脳排出指標 (Brain Efflux Index)を測定する方法論や単離脈絡叢を用いた解析から、有機アニオンの場合、細胞内から血液中へのくみ出しだけではなく、脳側から細胞内への取り込み過程にもトランスポーターが働いていることが示されている。両者が協関する事で方向性のある輸送が達成され、効率的に異物を排出していることが示唆されている。これまでに、脂溶性の高いbulkyな有機アニオンを基質とする排出輸送機構と水溶性の有機アニオンを基質とする排出輸送機構が存在している事を明らかにしている。最近、多くのトランスポーター遺伝子が単離されており、そのいくつかは関門での発現が報告されている。トランスポーターに対する阻害剤を用いた解析により、肝臓型の有機アニオントランスポーターであるorganic anion transporting polypeptide (Oatp/OATP) familyが脂溶性の高い有機アニオンの排出に、腎臓型の有機アニオントランスポーターであるorganic anion transporter (Oat/OAT) familyが水溶性有機アニオンの排出にそれぞれ関与していることを見出している(図2)。これらトランスポーターにより細胞内への取り込み過程の多くが説明されるが、その後の血液中への排出過程に関わるトランスポーターについてはほとんど明らかにされておらず、現在検討を行っている。関門における排出輸送の個人差は、脳内濃度の個人差ひいては薬効・副作用の個人差の一因となりえることから、ヒト有機アニオントランスポーターの遺伝子多型、また同じく脳内濃度に影響を与える要因として薬物間相互作用に着目し、現在検討を進めている。


図2 血液脳関門・血液脳脊髄液関門を介した異物排泄機構の模式図

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3. 薬物の肝臓への取り込み、胆汁排泄機構の解明

肝臓が薬物の主な解毒臓器である事を考えると、薬物の肝臓への取り込み、胆汁排泄機構を解明することの重要性は言うまでもない。当教室では既に種々のアニオン性、カチオン性化合物の肝への取り込みに能動輸送機構が関わる事を速度論的手法により明らかにしてきた。近年、げっ歯類やヒトにおいて一連のトランスポーターのクローニングが進められてきている。例えば、有機アニオン性化合物の輸送には、主にOATP(organic anion transporting polypeptide)ファミリーのトランスポーター、胆汁酸に関しては、主にNTCP(Na+-taurocholate cotransporting polypeptide)が、また有機カチオン化合物の輸送には、OCT(organic cation transporter)ファミリーがそれぞれ関与している(図3)。これらトランスポーターは、それぞれ非常に広範な基質特異性を有し、内因性の胆汁酸やステロイド抱合体、またプラバスタチンやメトトレキセートなど多種の薬物も基質にする。当研究室では、遺伝子発現哺乳類細胞を用いた各トランスポーターの機能解析、基質特異性の解析を行い、種々の薬物動態における各トランスポーターの寄与率を定量的に評価する方法論の構築、検討を進めている。近年では、ヒト凍結肝細胞を用いて、ヒトにおける肝臓の取り込みの検討も行えるようになった。また、評価法についても各トランスポーター特異的な阻害剤や基質を用いた方法のみならず、ノックアウトマウスやRNAi(RNA interference)法などを用いた遺伝子特異的ノックダウンによる検討も進めている。

また、有機アニオン系化合物の胆汁排泄機構にも、ATPの加水分解に直接共役した一次性能動輸送の関与が明らかとなっており、種々の実験系を用いた検討を行ってきた。当教室では、自然発生的に見出された高ビリルビン血症を示すラット(現在では、EHBR (Eisai Hyperbilirubinemic rat)と命名されている。)の原因として、MRP2 (multidrug resistance associated protein 2)遺伝子のナンセンス変異を見出し、この排泄輸送担体のcDNAクローニングにも成功をおさめ、細胞膜ベシクルなどを用いた機能解析、基質認識/輸送に関与するアミノ酸残基の同定等を進めてきた。なお、本遺伝子は、ヒトにおけるDubin-Johnson症候群の疾患遺伝子としても同定されており、現在ヒトMRP2に関しても同様の検討を進めている。本トランスポーターも取り込み側同様、非常に幅広く有機アニオンを認識し、薬物や内因性物質の胆汁排泄に重要な役割を果たしている。また、胆管側には他に有機カチオンや中性の化合物の輸送に関わる、P-gp(P-glycoprotein)、種々の胆汁酸を認識するBSEP(bile salt export pump)や、BCRP(breast cancer resistance protein)などが同定されており(図3)、特にBCRPは、当教室での検討により、種々の硫酸抱合体を特に良好な基質とすることから、今までに見出されなかった硫酸抱合体の排泄システムとして注目を集めており、ノックアウトマウスなどを用いたin vivoでの検討を進めている。


図3 肝臓に存在する排出輸送担体とその機能協関

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図4 in vitro実験を用いたin vivoでの肝クリアランス予測

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4. 薬物間相互作用の解析

通常、臨床での薬物治療を考えた場合、単剤による治療よりむしろ複数の薬物が併用投与されるケースが多く、時として予期せぬ作用減弱や副作用発現が見られるケースがある。我々は特に、薬物動態学的相互作用、すなわち薬が作用標的部位(レセプターなど)における濃度推移を支配する各段階(代謝酵素、トランスポーター)における相互作用に着目し、in vitro実験系の結果から、in vivoでの相互作用を定量的に評価しうる実験系の構築を目指して研究を進めてきた(図5)。代謝酵素における相互作用については、主に第1相酸化代謝に関わるCYP (cytochrome P450)における酵素反応の競合、非競合阻害が最もよく研究されてきているが、他にも、リファンピシン、フェノバルビタールなどにより引き起こされる酵素誘導による併用薬の代謝の促進、また、代謝産物が酵素自身と共有結合するなどして酵素を不可逆的に阻害するmechanism-based inhibitionなどが挙げられる。我々は、これらに対してアプローチするため種々の数学的モデルを提案し、in vitro実験から得た速度論的パラメータを用いてin vivo実験における血中濃度の変化を良好に予測しうる事を実証してきた。その方法論の一部は、厚生省のガイドラインにも相互作用のfalse negativeを避けるための予測法として導入されており、実際の創薬現場でも適用されている。また、トランスポーターに関しては代謝酵素に比べて歴史が浅く、現在精力的に研究がすすんでいる。当教室では、cyclosporin Aとcerivastatinの相互作用メカニズムとして、肝取り込み過程のトランスポーターを介した相互作用である事をin vitroおよびin vivo実験の両方を用いて定量的に示し、トランスポーターにおける相互作用も無視できない事を広く世にアピールする研究となった。今後、創薬段階や、臨床において重篤な相互作用を未然に防ぐためのアプローチを提唱すべく、分子生物学的手法と速度論的思考を統合した研究を進めていくつもりである。


図5 薬物間相互作用のターゲットサイト

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5.小児肝臓難病の病態解明、診断・治療法の開発に関する研究

肝内胆汁うっ滞が病態の発症・進展の原因となる肝臓難病が多数存在する。現在、当該難病には有効な治療法は確立していない。一部の難病には肝移植が著効するが、肝移植は極度の身体的負担に加え、ドナー不足の問題も抱える治療法である。そのため、当該難病を包括する新たな医薬品の開発が切望されている。

Bile salt export pump(BSEP)は、肝細胞の毛細胆管に面した細胞膜に発現し、肝細胞内の胆汁酸を毛細胆管中へと排泄するABCトランスポーターである。BSEPの遺伝子変異が原因で発症する進行性家族性肝内胆汁うっ滞症2型(PFIC2)は、上記のうち最も重篤な肝臓難病の一つとして知られる。当研究室では、本疾患の肝内胆汁うっ滞が、BSEPの細胞膜発現量の減弱に起因することを明らかにした後、本機序に基づく創薬研究を推進し、尿素サイクル異常症治療薬のブフェニール(NaPB; sodium phenylbutyrate)が、BSEPの細胞膜発現量を増強する新規薬理作用を有することを独自に発見した。さらにPFIC2患児3例を対象にNaPBの有効性、安全性を検証する探索的臨床試験を実施し、本薬剤の服用により、全てのPFIC2患児において臨床所見(黄疸、原疾患に伴う難治性掻痒感・睡眠障害など)、肝機能検査値、肝組織病理像が有意に改善することを確認した。これらの知見に基づき、現在以下の研究を実施している。

①PFIC2を対象としたNaPBの有効性と安全性の検討を目的とした治験

NaPBを通常医療としてPFIC2患児に使えるようにするため、NaPBの上記効能に関する薬事承認取得に向けた取り組みを開始している。PFIC2を含む小児肝臓難病の多くでは国外、国内問わず疾患情報が集積されていない。そこで全国の小児肝臓病の専門医、関連学会などにご支援を頂き、これら疾患群の疾患自然歴、国内症例数などを把握するために全国疫学調査を実施した。そして本調査結果を基盤としたプロトコル作成を行い、2016年より治験を開始した(UMIN000024753)。

➁NaPBより高活性のBSEP増強剤の開発

PFIC2以外にもBSEPの細胞膜発現量の減弱が病態進展と関連する肝疾患が多数知られている。当研究室では、NaPBが当該疾患にも有効である可能性を示すエビデンスを臨床研究により取得している。しかしながら、当該薬効の発現には高用量が必要なため、自覚症状が速やかに改善する疾患を除き服薬アドヒアランスの低下が観察された。また、疾患によっては自己肝での生存期間の延長が期待できるほどの十分な臨床効果が得られなかった。そこで、製薬企業などの協力を得て、NaPBに比して高活性の医薬品開発を指向した研究を進めている。

➂独自に集積した臨床情報、生体試料を基盤とした小児肝臓難病の克服研究

上記研究を通じて集積した臨床情報、生体試料は、小児肝疾患領域において貴重なリソースである。当該疾患分野の研究基盤の確立、ひいては患児への還元を目的とし、これらのリソースを共有、拡充するシステムの構築を進めている。また本リソースを利活用した仮説検証により、病態機序が不明の難病、診断・治療法が未確立の難病の克服に向けた研究を展開している。

④トランスポーターの分解機構を標的とした創薬研究

 近年、動脈硬化症などの生活習慣病から希少難病に至るまで、トランスポーターの活性化が、病態発症・進展を抑制できると考えられる疾患が多数同定されている。これら疾患の多くでは、既存の医療で十分な治療効果が得られておらず、新たな医薬品開発が切望されている。当研究室は、NaPBが、BSEPの分解機構を抑制することにより、BSEPの細胞膜発現量、機能を増強し、上記臨床効果をもたらすことを見出している。本実例に則し、トランスポーターの分解機構に着目した創薬研究を実施している。