研究内容

0. 研究の概要

生命は生体内における物質の質的な変化、量的な流れの微妙な調節によって保たれている。薬物の作用もまた生体内の薬の動きによって大きく影響を受ける。試験管の中では薬理作用を持つ化合物も、生体内に投与した場合には必ずしも期待される効果が得られない事があるのは周知の事実である。これは投与された化合物の濃度や暴露時間を十分確保できないためである。従って、生体内での薬の動きを予測し、薬効が期待できるのかどうか早い段階で評価する方法論の開発は医薬品開発のリスクを大きく軽減することができる。また、薬の排泄経路についても、単一の消失経路では薬物間相互作用や遺伝子多型など個人差の影響を受けやすいため複数の排泄経路を持つ医薬品を開発することがより安全な医薬品による疾病治療のためには必要である。その上で、標的臓器に選択的に薬を分布させるようなドラッグデリバリーシステム(DDS)を開発し、薬の体内動態を制御することで、医薬品による疾病治療の効率が飛躍的に上昇することが期待される。当研究室では、これを最終目標におき、薬の体内動態における支配要因の解析、特に生体膜透過機構の解明を行っている。

これまで、医学、薬学の分野では、個体レベルでの現象の本質(機構)を理解するために、臓器、細胞、蛋白、遺伝子レベルへと遡る解析的な研究が推進され、大いなる成果をあげてきた。しかしながら、こうして解明された分子レベルでの機構をもとに、個体レベルでの現象を定量的に再構築する事を可能にするような方法論が開発されない限り、“効果と安全性の予測と制御”という上記の目的を果たすことはできない。医薬品が最終的に薬効を発揮するためには、(1)投与部位から循環血中への吸収過程、(2)代謝、排泄などの解毒過程、(3)薬効、副作用に関わる組織への移行過程、(4)薬効に関わる受容体への結合、それに続く薬効発現などの諸過程を経なければならない。これらの諸過程は、臓器血流、細胞内外のpH差、電位差などの生理解剖学的パラメーターと、血中、組織中の蛋白への結合性、生体膜透過性、輸送担体(トランスポーター)および代謝酵素と薬物の相互作用、薬効および副作用に関わる受容体への結合、情報伝達過程などを表す生化学的パラメーターにより表現することが可能である。従って、これらパラメーターを適切な数学モデルに組み込むことにより、“薬の投与量、投与経路”、“投与される患者の病態”という入力情報から、“薬効および副作用の発現”という出力を予測する事を試みており、既にいくつかの成功例を得ている。実際に動いている実験手法は、細胞生物学、分子生物学の研究室と同様のものが多いが、その背景となっている”生体内でのダイナミックな薬物分子、蛋白分子の動きを定量的に解析をする”という基本理念において、他の研究室との違いがあると考えている。現在、具体的に進行している研究テーマは下記の5つに分けることができる。

1. 生理学的薬物速度論モデルによる薬物体内動態予測法の確立

薬物による効果、副作用を予測するためには、薬物血中濃度推移の予測が必須である。血中濃度推移は、1)肝での代謝、排泄クリアランスおよび腎での排泄クリアランス、2)種々の組織への分布の程度(分布容積)により記述することができる。ヒトにおけるこれらパラメーターを、種々のin vitro実験系(単離細胞膜、遊離細胞、灌流臓器)で得た測定値(代謝、輸送、結合)をもとに、生理解剖学的パラメーターと結合し、適切な数学モデルを用いて予測する方法論を開発している(図1)。腎クリアランスについては、実験動物での情報をもとにアニマルスケールアップの手法を適用することにより、ヒトでの値を予測することに多くの例で成功している。しかし、肝代謝クリアランスや肝取り込み、胆汁中排泄クリアランス、消化管吸収クリアランスなどについては動物種差が大きいため、ヒトの組織やミクロソーム、P450発現系などを用いたin vitro代謝実験、輸送実験で得られたデータをもとに、in vivoでの代謝、輸送クリアランスを予測することを試みている。また、近年、種々の薬物間相互作用に基づく副作用の発現が問題となっており、社会問題ともなっている。薬物間相互作用により変動し得る体内動態の要因としては、薬物の吸収、血漿蛋白結合、トランスポーターによる生体膜透過、および代謝が挙げられる。現在、主に代謝、排泄における薬物間相互作用を、in vitro実験によりできるだけ精度よく予測するための方法論について検討している。更にデータマイニングの手法を取り入れ、文献データに現在の分子論的理解を加えることで、体内動態の個人差の予測、薬物間相互作用の予測を行っている。こうした研究は、最終的には副作用の少ない医薬品の開発、使用法の確立につながるものであり、“薬学研究”に関わる者としての使命を感じながら研究を進めている。


図1 生理学的薬物速度論に基づいた薬物体内動態の予測

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2. 薬物の血液脳関門および血液脳脊髄液関門透過機構の解明、および脳内動態予測法の確立

In vivo系での中枢における薬物動態を予測するためには、血液と中枢とのインタフェースとなっている血液脳関門・血液脳脊髄液関門を介した薬物輸送能力を知ることが必要である。In vitroならびにin vivoでの解析を通じて、多くの興味ある事実が見出された。血液脳関門・血液脳脊髄液関門の関門機構はこれまで内皮細胞間あるいは上皮細胞間の密着結合などに由来するものと解釈されてきたが、最近の速度論的、分子生物学的研究により、”いったん脳内皮細胞に取り込まれた異物が、P-glycoproteinなどのトランスポーターの働きにより能動的に血液中に汲み出されているために正味の脳移行が制限されている”ことが明らかにされている。加えて関門では抱合酵素なども発現しており、血液脳関門・血液脳脊髄液関門は、これまで考えられていたような静的な壁ではなく、トランスポーターや代謝酵素など異物解毒機構により構成されるよりダイナミックな障壁であることが認識され始めている。

中枢から血液中へのくみ出し過程には、脳実質内・脊髄液内から内皮・上皮細胞内への取り込みと細胞内から血液中へのくみ出しの2つの過程から成り立っている。当研究室で最近開発された脳排出指標 (Brain Efflux Index)を測定する方法論や単離脈絡叢を用いた解析から、有機アニオンの場合、細胞内から血液中へのくみ出しだけではなく、脳側から細胞内への取り込み過程にもトランスポーターが働いていることが示されている。両者が協関する事で方向性のある輸送が達成され、効率的に異物を排出していることが示唆されている。これまでに、脂溶性の高いbulkyな有機アニオンを基質とする排出輸送機構と水溶性の有機アニオンを基質とする排出輸送機構が存在している事を明らかにしている。最近、多くのトランスポーター遺伝子が単離されており、そのいくつかは関門での発現が報告されている。トランスポーターに対する阻害剤を用いた解析により、肝臓型の有機アニオントランスポーターであるorganic anion transporting polypeptide (Oatp/OATP) familyが脂溶性の高い有機アニオンの排出に、腎臓型の有機アニオントランスポーターであるorganic anion transporter (Oat/OAT) familyが水溶性有機アニオンの排出にそれぞれ関与していることを見出している(図2)。これらトランスポーターにより細胞内への取り込み過程の多くが説明されるが、その後の血液中への排出過程に関わるトランスポーターについてはほとんど明らかにされておらず、現在検討を行っている。関門における排出輸送の個人差は、脳内濃度の個人差ひいては薬効・副作用の個人差の一因となりえることから、ヒト有機アニオントランスポーターの遺伝子多型、また同じく脳内濃度に影響を与える要因として薬物間相互作用に着目し、現在検討を進めている。


図2 血液脳関門・血液脳脊髄液関門を介した異物排泄機構の模式図

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3. 薬物の肝臓への取り込み、胆汁排泄機構の解明

肝臓が薬物の主な解毒臓器である事を考えると、薬物の肝臓への取り込み、胆汁排泄機構を解明することの重要性は言うまでもない。当教室では既に種々のアニオン性、カチオン性化合物の肝への取り込みに能動輸送機構が関わる事を速度論的手法により明らかにしてきた。近年、げっ歯類やヒトにおいて一連のトランスポーターのクローニングが進められてきている。例えば、有機アニオン性化合物の輸送には、主にOATP(organic anion transporting polypeptide)ファミリーのトランスポーター、胆汁酸に関しては、主にNTCP(Na+-taurocholate cotransporting polypeptide)が、また有機カチオン化合物の輸送には、OCT(organic cation transporter)ファミリーがそれぞれ関与している(図3)。これらトランスポーターは、それぞれ非常に広範な基質特異性を有し、内因性の胆汁酸やステロイド抱合体、またプラバスタチンやメトトレキセートなど多種の薬物も基質にする。当研究室では、遺伝子発現哺乳類細胞を用いた各トランスポーターの機能解析、基質特異性の解析を行い、種々の薬物動態における各トランスポーターの寄与率を定量的に評価する方法論の構築、検討を進めている。近年では、ヒト凍結肝細胞を用いて、ヒトにおける肝臓の取り込みの検討も行えるようになった。また、評価法についても各トランスポーター特異的な阻害剤や基質を用いた方法のみならず、ノックアウトマウスやRNAi(RNA interference)法などを用いた遺伝子特異的ノックダウンによる検討も進めている。

また、有機アニオン系化合物の胆汁排泄機構にも、ATPの加水分解に直接共役した一次性能動輸送の関与が明らかとなっており、種々の実験系を用いた検討を行ってきた。当教室では、自然発生的に見出された高ビリルビン血症を示すラット(現在では、EHBR (Eisai Hyperbilirubinemic rat)と命名されている。)の原因として、MRP2 (multidrug resistance associated protein 2)遺伝子のナンセンス変異を見出し、この排泄輸送担体のcDNAクローニングにも成功をおさめ、細胞膜ベシクルなどを用いた機能解析、基質認識/輸送に関与するアミノ酸残基の同定等を進めてきた。なお、本遺伝子は、ヒトにおけるDubin-Johnson症候群の疾患遺伝子としても同定されており、現在ヒトMRP2に関しても同様の検討を進めている。本トランスポーターも取り込み側同様、非常に幅広く有機アニオンを認識し、薬物や内因性物質の胆汁排泄に重要な役割を果たしている。また、胆管側には他に有機カチオンや中性の化合物の輸送に関わる、P-gp(P-glycoprotein)、種々の胆汁酸を認識するBSEP(bile salt export pump)や、BCRP(breast cancer resistance protein)などが同定されており(図3)、特にBCRPは、当教室での検討により、種々の硫酸抱合体を特に良好な基質とすることから、今までに見出されなかった硫酸抱合体の排泄システムとして注目を集めており、ノックアウトマウスなどを用いたin vivoでの検討を進めている。


図3 肝臓に存在する排出輸送担体とその機能協関

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図4 in vitro実験を用いたin vivoでの肝クリアランス予測

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4. 薬物間相互作用の解析

通常、臨床での薬物治療を考えた場合、単剤による治療よりむしろ複数の薬物が併用投与されるケースが多く、時として予期せぬ作用減弱や副作用発現が見られるケースがある。我々は特に、薬物動態学的相互作用、すなわち薬が作用標的部位(レセプターなど)における濃度推移を支配する各段階(代謝酵素、トランスポーター)における相互作用に着目し、in vitro実験系の結果から、in vivoでの相互作用を定量的に評価しうる実験系の構築を目指して研究を進めてきた(図5)。代謝酵素における相互作用については、主に第1相酸化代謝に関わるCYP (cytochrome P450)における酵素反応の競合、非競合阻害が最もよく研究されてきているが、他にも、リファンピシン、フェノバルビタールなどにより引き起こされる酵素誘導による併用薬の代謝の促進、また、代謝産物が酵素自身と共有結合するなどして酵素を不可逆的に阻害するmechanism-based inhibitionなどが挙げられる。我々は、これらに対してアプローチするため種々の数学的モデルを提案し、in vitro実験から得た速度論的パラメータを用いてin vivo実験における血中濃度の変化を良好に予測しうる事を実証してきた。その方法論の一部は、厚生省のガイドラインにも相互作用のfalse negativeを避けるための予測法として導入されており、実際の創薬現場でも適用されている。また、トランスポーターに関しては代謝酵素に比べて歴史が浅く、現在精力的に研究がすすんでいる。当教室では、cyclosporin Aとcerivastatinの相互作用メカニズムとして、肝取り込み過程のトランスポーターを介した相互作用である事をin vitroおよびin vivo実験の両方を用いて定量的に示し、トランスポーターにおける相互作用も無視できない事を広く世にアピールする研究となった。今後、創薬段階や、臨床において重篤な相互作用を未然に防ぐためのアプローチを提唱すべく、分子生物学的手法と速度論的思考を統合した研究を進めていくつもりである。


図5 薬物間相互作用のターゲットサイト

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5.トランスポーターを標的とした創薬研究

トランスポーターの多くは細胞膜上に存在し、細胞内外の物質交換の役割を担っている。外部刺激によるストレスやトランスポーターの遺伝子変異により、トランスポーターの機能破綻が生じ、様々な疾患の発症につながることが報告されている。しかしながら、現状ではこれらの疾患に対する医薬品開発はほとんど進んでいない。そこで、当研究室ではトランスポーター関連疾患の治療を実現すべく以下の研究を進めている。

Bile Salt Export Pump(BSEP)は、肝細胞毛細胆管側膜に発現し、肝細胞から胆汁中への胆汁酸排泄を担うトランスポーターである。その機能低下は肝内胆汁うっ滞を惹起するが、特に重篤な症状を呈する疾患として、BSEPの遺伝子変異が原因となり発症する進行性家族性肝内胆汁うっ滞症2型(PFIC2)が知られている。PFIC2は生後まもなくから始まる慢性的な肝内胆汁うっ滞により、致死性の経過をたどる難治性肝疾患である。内科的療法は未だ確立しておらず、肝移植が唯一の治療法となる。
当研究室ではこれまでに、大部分のPFIC2症例に関しては、BSEPの細胞膜発現量の減少に伴い、BSEPが機能破綻し、病態が発症していることを明らかにしている。さらに、本知見に基づき、BSEPの細胞膜発現量を増強する化合物の探索に取り組み、尿素サイクル異常症治療薬である4-phenylbutyrate(4PB)を陽性化合物として同定することに成功した。ラットを用いた解析では、4PBの投与により、BSEPの発現量、機能の増加が認められ、尿素サイクル異常症患者の検体を用いたレトロスペクティブ研究においても、4PB服用後にBSEPの発現量増加が確認された。以上の結果は、PFIC2に対する4PBの治療効果を期待させるものであることから、全国の複数の医療施設との共同研究体制を整え、倫理委員会の承認の下、探索的臨床研究を実施した。これまでに試験終了した症例では、ビリルビンなどの肝機能検査値が正常化し、肝組織学的検査においても、BSEPの発現量増加、肝内胆汁うっ滞像の消失が観察されており、4PBがPFIC2症例に奏功する知見が得られている。現在、フェニルブチレートの本薬効に関して薬事法上の承認を得るための臨床研究(治験)を開始する準備を進めている。今後、治験を経て本効能が追加承認されれば、肝移植に代わる新規治療法として広く普及することが期待される。
PFIC2以外にもBSEPの発現量低下により発症、増悪する疾患が知られている。今後は、当該疾患を対象とした臨床研究を実施し、4PBの更なる適応拡大の可能性を検討する予定である。また、今回BSEPを標的として実施した創薬方法論を一般化すべく、疾患と関連する他のトランスポーターに着目した研究も進めている。